Characterization of two methods for structuring biointerfaces with DNA nanotechnology

Abstract

Die Untersuchungen der Interaktion von Zellen mit räumlich definierten Anordnungen von Proteinen hat sich als vielseitige Methode in der zellbiologischen Forschung etabliert. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von zwei Methoden, welche die Strukturierung von Proteinen durch DNS-Nanotechnologie auf Mikro- beziehungsweise Nanometerebene ermöglichen, zu unterstützen und diese näher zu charakterisieren. Einerseits wurden in einer Lipid-Doppelmembran verankerte DNA Origami Plattformen, die präzise Proteinanordnungen auf Nanometerebene erlauben, mithilfe von Einzelmolekül- Fluoreszenzmikroskopie im Hinblick auf ihre Mobilität und den Grad ihrer Funktionalisierung charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass nur die Hälfte der DNA Origami die nominelle Anzahl an Modifikationen aufwies und der Arbeitsschritt im Herstellungsprozess, der zu dieser ineffizienten Funktionalisierung führte, wurde identifiziert. Andererseits wurde eine zuvor nur in zellfreier Umgebung beschriebene Methode, die „toehold-mediated strand displacement“ nutzt, um dynamische, mikrostrukturierte Protein- anordnungen herzustellen, erfolgreich im zellulären Kontext angewandt. Um dies zu ermöglichen, wurden DNS-Antikörper Konjugate hergestellt, mit denen die reversible Strukturierung von Proteinen in der Plasmamembran lebender Zellen gezeigt werden konnte.

Presenting cells with defined arrangements of immobilized proteins has proven to be a versatile method in cell biological research. The goal of this work was to aid in the development and characterization of two methods that employ DNA nanotechnology to produce micro- and nanostructured protein patterns for applications in immunology and cell biology. On the one hand, lipid bilayer-anchored DNA Origami structures, capable of displaying precise protein arrangements on the nanoscale, were characterized via single molecule fluorescence microscopy regarding their mobility and degree of functionalization. It was found that only half of the DNA Origami platforms displayed the nominal number of modifications and the step during synthesis of platforms that led to inefficient functionalization was identified. On the other hand, a method employing toehold-mediated strand displacement for establishing dynamic micropatterns was, for the first time, successfully applied in a cellular context. For this, DNA-antibody conjugates were produced that allowed the creation of reversible protein micropatterns in the plasma membrane of living cells.