Application of single-molecule microscopy techniques to characterize the T cell receptor on the membrane of T cells

Abstract

Die Immunologie als Lehre der Abwehrmechanismen eines lebenden Organismus gegen infektiöse Erreger stellt seit der ersten Impfung im Jahr 1796 einen der zentralsten Punkte der modernen Medizin dar. Gerade in Zeiten der immer weiter verbreiteten Impfkritik kann diese Wichtigkeit in unserer Gesellschaft nicht genug betont werden. Im Gegensatz zu wirbellosen Tieren, verfügen Vertebrata über ein adaptives Immunsystem, ein höchst ausgefeiltes Abwehrsystem, welches sich durch ständige Weiterentwicklung auszeichnet. Dieses adaptive Abwehrsystem basiert auf einigen unterschiedlichen, hoch spezialisierten Zellarten. Unter diesen spielen die T-Zellen die Rolle des Initiators, indem sie Fremdkörper, welche von anderen Zellen präsentiert werden, erkennen, und eine Immunabwehrreaktion in Gang setzen können. Die als „fremd“ erkannte Struktur (das Antigen) wird von einem Oberflächenprotein der T-Zelle, dem T-Zell-Rezeptor, erkannt. Dieser stellt somit einen zentralen Punkt in der Abwehrreaktion dar. Trotz der bedeutenden Rolle des T-Zell-Rezeptors in der Immunabwehr sind nach wie vor einige zentrale Fragen in Bezug auf dessen funktionale und physikalische Charakteristika ungelöst. Eigenschaften des Rezeptors wie dessen Mobilität in der Zellmembran, dessen Aufbau aus mehreren Untereinheiten, oder die Anordnung der Rezeptoren in der Zellmembran, beeinflussen mit hoher Wahrscheinlichkeit seine Funktion im Zuge der Antigen-Erkennung. In dieser Arbeit widmete ich mich den genannten physikalischen Eigenschaften des T-Zell-Rezeptors, um zu einem besseren Verständnis der von der T-Zelle induzierten Immunabwehrreaktion beizutragen. Hierzu verwendete ich hoch-auflösende Lichtmikroskopie-Verfahren: Ich untersuchte die Mobilität des T-Zell-Rezeptors mittels der Verfolgung einzelner Rezeptoren in der Zellmembran. Außerdem untersuchte ich die Stöchiometrie der T-Zell-Rezeptor-Komplexe mittels der Einzelmolekül-Methoden TOCCSL, FRET, sowie PA/FCS. Die Verteilung der Rezeptoren in der Zellmembran von T-Zellen konnte durch Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie festgestellt, und mittels STED-Mikroskopie verifiziert werden. Durch ausführliche Simulationsstudien wurden die Ergebnisse weiter unterstützt. Die Resultate dieser Studien zeigen, dass die T-Zell-Rezeptoren vergleichsweise langsam in der Zellmembran diffundieren, aus einer TCR und zwei CD3 Untereinheiten aufgebaut sind, und im Wesentlichen zufällig verteilt in der Zellmembran vorliegen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wird ein neues 2-Phasen-Modell vorgeschlagen, welches versucht, die hohe Geschwindigkeit der T-Zellen bei der Identifikation von Fremdkörpern zu erklären.

The health of any organism critically depends on the correct and efficient functionality of its immune system. Malfunctioning might manifest itself in illnesses such as AIDS, Type 1 Diabetes Mellitus or Multiple Sclerosis. A central constituent of the adaptive immune system are T cells, which are able to distinguish foreign from endogenous substances and can thereby initiate a defensive response on potential threats. The surface protein responsible for the recognition of those threats is the T cell receptor (TCR), which bears the uttermost important role within the adaptive immune response. Nevertheless, the knowledge on many of the receptors characteristics, which might be pivotal for its function, is still limited and published results are highly controversial. Within this work, I used novel fluorescence microscopy techniques to strengthen, extend and tackle the current ideas on three specific topics: i) the TCRs mobility within the plasma membrane, ii) the oligomerization state of the TCR/CD3 complex, and iii) the receptors spatial distribution within the plasma membrane. Single-molecule tracking and Fluorescence Correlation Spectroscopy were used to measure the diffusion of the TCR. Large discrepancies on this aspect found in the literature motivated these approaches. The TCR/CD3 complex was found to diffuse slowly within the plasma membrane. While about a third of all complexes showed basically no mobility at all, the remaining two thirds were measured to have a diffusion coefficient of D 0.045 m/s2. Next, I used FRET, TOCCSL, and PA/FCS to investigate the subunit composition of the TCR/CD3 complex, as there is still a lack of studies tackling this question by using minimally invasive methods. By this, I could confirm the widely favoured model of one TCR and two CD3 subunits. A T cell activation model based on the receptors spatial distribution within the membrane was recently proposed. The experiments, on which this model is based, were realized using single-molecule localization microscopy (SMLM) methods. In recent years, however, it was shown that these methods come along with major challenges in quantitation. To this end, we used SMLM combined with a novel analysis approach to re-evaluate the receptors spatial distribution. Additional STED experiments strengthened our results by offering a complementary approach. Both experimental approaches were further supplemented with extensive Monte Carlo simulations. The model of TCR nanoclustering, however, could not be verified by either label-density variation SMLM or STED. Both methods showed that significant nanoclustering of the TCRs is highly unlikely. Based on those findings, a new model for T cell activation is proposed: A two-phase search approach, in which the time for a T cell to identify an agonistic antigen within a majority of endogenous ones is decreased by several orders of magnitude, while preserving the typical high specificity of the TCR.