DNA origami as a nanoscale tool for T-cell activation

Abstract

T-Zellen detektieren hochselektiv sogar einzelne Antigene, von Haupthistokompatibilitätskomplexen(MHC) präsentierte körperfremde Peptide, auf der Oberflächevon Antigenpräsentierenden Zellen (APC), obwohl T-Zellrezeptoren (TCR)diese nur mit mikromolarer Affinität binden. Wie dies möglich ist, ist nach wievor ungeklärt, jedoch gibt es indirekte Beweise, die die räumliche Verteilungvon Antigenen auf der APC Oberfläche als einen kritischen Faktor für diesenErkennungsmechanismus sehen.Das Hauptziel dieser Dissertation war, die Notwendigkeit spezifischer räumlicherAnordnungen von TCRs und/oder TCR Liganden für eine effiziente TZellaktivierungzu bestimmen. Dazu wurde eine biomimetische Oberflächezur Zellinteraktion entwickelt, die folgenden Zweck erfüllen sollte: Zum einensollte eine experimentell kontrollierbare und akkurate Positionierung von Ligandenund deren Distanzen zueinander mit Nanometer-Präzision möglich sein.Zum anderen sollte die mikroskopische Reorganisation der Liganden und Rezeptorenim Rahmen der T-Zellaktivierung unterstützt werden. Zu diesem Zweckverwendeten wir rechteckige DNS-Origami Plattformen, die auf einer fluidenplanaren Lipiddoppelschicht (SLB) verankert und mit TCR Liganden funktionalisiertwurden.Wir konnten feststellen, dass T-Zellaktivierung mittels TCR-reaktiver monovalenterAntikörperfragmente (scFV) die unmittelbare Nähe (δ ≤ 20nm) zwischendiesen Liganden voraussetzt. Dies deutet darauf hin, dass sich AntikörpergebundeneTCRs für eine potente Immunantwort in unmittelbarer Nähe zueinanderbefinden müssen.Diese Voraussetzungen galten jedoch nicht für den physiologischen TCR Liganden,Antigen-beladene MHCs (pMHCs), die sehr wohl in der Lage waren, TZellenals isolierte Einheiten zu stimulieren. Bei Verwendung von TCR:pMHCPaaren mit einer erhöhten Interaktionsdauer stellten wir allerdings fest, dass dieentsprechende Signalantwort in Analogie zum scFV von der räumlichen Anordnungder pMHC Moleküle abhing.Unsere Daten deuten im Gesamten darauf hin, dass die T-Zellaktivierung vonkleinen Clustern stimulierter TCRs abhängt. Diese können entweder durch lang anhaltende TCR:Liganden Bindungen entstehen, wobei zumindest zwei TCRsin einem maximalen Abstand von 20nm zueinander stehen müssen, oder durchwiederholte, kurzlebige Interaktionen mit einzelnen pMHC Molekülen gebildetwerden.

T-cells recognize the presence of even a single foreign peptide-loaded majorhistocompatibility complex (pMHC) on the surface of antigen presenting cells(APC) even though their T-cell antigen receptors (TCR) bind with micromolaraffinity. How they achieve this is still poorly understood, yet indirect evidencepointed to spatial antigen arrangement on the APC surface as a critical factorfor this recognition process.The main aim of this thesis was to determine the spatial requirements forT-cell activation. For this, we designed a cell-responsive biointerface, whichshould feature experimentally controllable and defined adjustment of liganddistances on the nanoscale while permitting at the same time the microscopicreorganization of ligands and receptors in the course of T-cell activation. To thisend, we employed rectangular DNA origami platforms anchored to fluid planarsupported lipid bilayers (SLB) and functionalized with TCR ligands.We found that T-cell activation via TCR-reactive monovalent single chain antibodyfragments (scFV) requires close proximity (≤ 20nm) of ligands withinunits of at least two molecules, indicating that TCRs must be antibody-engagedin close proximity to initiate a potent immune response.This held no longer true for the physiological TCR ligand, cognate pMHCs,which were well capable of stimulating T-cells as well-isolated entities. However,when we employed TCR:pMHC pairs with increased interaction half-lives,the signaling response was dependent on the spatial organization of pMHCmolecules in analogy to antibody-mediated TCR triggering.Together, our data indicate that early T-cell signaling emerges from small assembliesof triggered TCRs, which can be formed either by prolonged TCR:ligandengagement of closely spaced TCRs or by repeated short-lived interactions viasingle cognate pMHC molecules.