Preparation of substrates for in vivo nanopatterning of membrane proteins for super-resolution microscopy

Abstract

Membranproteine sind die Schnittstelle der Zellkommunikation und das Ziel von mehr als 60 % aller Medikamente. Ihre quantitative Analyse ist jedoch nach wie vor herausfordernd, da die hochkomplexe, lokale Umgebung bestehend unter anderem aus weiteren Proteinen entscheidend für ihre Funktionalität ist. Unsere Gruppe stellte 2008 eine Methode vor, die es erlaubt, die Interaktion von Membranproteinen in Raum und Zeit zu verfolgen. Hierfür werden die Zellen auf mikrostrukturierte Substrate gebracht, die die Membranproteine in vivo auf periodische Bereiche fixieren. Die laterale Verteilung von markierten Zielproteinen wird dabei in der lebenden Zelle mittels total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) verfolgt. Bei Interaktion wird die räumliche Verteilung der Zielproteine der der fixierten Membranproteine entsprechen, während anderenfalls eine eher gleichmäßige Verteilung über den verfügbaren Raum vorliegt. Die Grundlage dieser Methode stellt das Substrat dar, welches die Anordnung der Membranproteine strukturiert. Hierfür wird ein zweidimensionales Muster von Fang- und Blockproteinen auf einer TIRFM-geeigneten Oberfläche aufgebracht. Die laterale Auflösung der Methode zur Interaktionsdetektion ist dabei vorrangig über die Periodizität dieses Proteinmusters definiert. Die Analyse räumlicher Heterogenitäten in der Protein-Protein-Wechselwirkung erfordert die Abfrage von Kontrastwerten bei einer räumlichen Frequenz, die höher ist als die Auflösung des Proteinmusters. Um die laterale Auflösung in den Größenbereich von einem Mikrometer zu bringen, ist aufgrund des Nyquist- Theorems eine Periode von weniger als 500nm erforderlich. In dieser Arbeit wird eine einfache Methode vorgestellt, um mittels nanocontact printing (nCP) Substrate mit Proteinmustern herzustellen, die eine Periode deutlich unter der optischen Auflösungsgrenze von 200nm erreichen können. Hierfür wird nCP mit einem Silikon durchgeführt, welches 2009 urspünglich für eine Variation von nanoimprint lithography (NIL) entwickelt und noch nicht für nCP verwendet wurde. Zuerst wurden mit phase transition mastering (PTM) Master hergestellt und davon Silikonstempel abgeformt. Es wurden hierfür zwei Arten von Silikonen mit hohem Elastizitätsmodul verwendet und die Strukturform, -durchmesser und -periode bis an die technischen Grenzen von PTM variiert. Daraus konnte gefolgert werden, welcher Härtegrad des Silikons für welche Geometrie benötigt wird. Ein ebenso wichtiger Bestandteil bei nCP ist die Substratvorbereitung und beschichtung und auch hier wurden mehrere Varianten überprüft, wobei sich eine Methode, die bislang noch nicht für CP oder nCP verwendet wurde, als die Beste erwies. Die Funktionalität der hergestellten Proteinmuster wurde mittels TIRFM und hochauflösender Mikroskopie überprüft. Anschließend wurde ein Master angefertigt, der eine Periode von 140nm aufwies und damit erfolgreich Protein-Nanomuster erstellt, wobei sich allerdings gezeigt hat, dass in dieser Größenordnung die Wahl des Proteins entscheidend ist. Diese Proteinmuster wurden mit atomic force microscopy (AFM) und Stimulated Emission Depletion (STED) microscopy untersucht. Mit diesen Nanomustern ist es möglich, die Auflösung der Interaktionsdetektion auf unter 300nm zu verringern.

Membrane proteins are the interface of cell communication and the target of more than 60 % of all medical drugs. However, their quantitative analysis remains challenging, as the highly complex local environment, including other proteins, is critical to their functionality. In 2008, our group presented a method that allows to track the interaction of membrane proteins in space and time. For this purpose, the cells are placed on micropatterned substrates, which fix the membrane proteins in vivo on periodic areas. The lateral distribution of a fluorescently labeled target protein is monitored in the living cell by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). In case of interaction, the spatial distribution of the target protein will be that of the fixed membrane protein, while otherwise a more even distribution across the available space will be present. The basis of this method is the substrate, which structures the arrangement of the membrane proteins. For this purpose, a two-dimensional pattern of anchor and block proteins is applied to a TIRFM-suitable substrate. The lateral resolution of the method for interaction detection is primarily defined by the periodicity of this protein pattern. Analysis of spatial heterogeneities in the protein-protein interaction requires the interrogation of contrast values at a spatial frequency which is higher than the desired resolution of the pattern. To improve the lateral resolution down to length-scales of one micrometer, a period of less than 500nm is necessary due to the Nyquist theorem. In this work a simple method to produce such substrates with protein patterns that can reach a period well below the optical resolution limit of 200nm is presented. For this purpose, nanocontact printing (nCP) is performed with a silicone that was originally developed in 2009 for a variation of nanoimprint lithography (NIL) and, to our knowledge, has not yet been used for contact printing. First, masters were produced by phase transition mastering (PTM) and silicone stamps were molded from them. Two types of silicones with high Youngs modulus were used and the structural shape, diameter and period were varied to the technical limits of PTM. From this it could be deduced which degree of hardness of the silicone is required for which geometry. An equally important part of nCP is substrate preparation and coating, and several variants have been reviewed. A coating material that has not yet been used for CP or nCP has been shown to give the best results. The functionality of the produced protein patterns was checked by TIRFM and super-resolution microscopy. Subsequently, a master was acquired that had a period of 140nm and nanopatterns were successfully created. At these length scales, the choice of the protein turned out to be crucial for success. These protein patterns were examined with atomic force microscopy (AFM) and stimulated emission depletion (STED) microscopy. With these nanopatterns, it will be possible to decrease the resolution of the protein interaction assay to below 300nm.