Electrochemical detection of biomolecules in lateral flow devices

Abstract

Lateral flow devices (LFDs) are low-cost, simple, and efficient tools that enable powerful diagnostics at patients point-of-care (POC). Decentralized healthcare solutions, like LFDs, are needed to mitigate pandemics and support treatments, no matter the location. This thesis presents the development of a novel electrochemical LFD for the quantification of C-reactive protein (CRP), an important marker for inflammation. The detection is enabled by a sandwich assay with capture antibodies immobilized on a nitrocellulose membrane and detection antibodies conjugated to an enzyme label. Initially, the system proof-of-concept confirmed the assay working principle and helped identify the parameters critical for performance. Using this information, the assay hardware was improved to enable consistent and reliable measuring conditions. To that end, a disposable electrochemical sensor as well as a handheld LFD housing were carefully designed and produced. Additionally, the LFD components were screened to find the combination offering the best experimental conditions. Next, the immunoassay was thoroughly examined. The composition of both the buffer and the blocking agent was investigated and optimized. Moreover, each conjugate reagent was investigated and adjusted accordingly. Furthermore, three LFD detection techniques were compared to find that electrochemistry had lower errors, better sensitivity, and a larger dynamic range. In the end, the finalized device was assembled, and tested using three approaches for the conjugate usage. It was identified that the aqueous mixing of conjugate with the sample provided the most reliable and sensitive results. There, the limit of detection (LOD) for CRP in the buffer was 5 ng/mL with an average coefficient of variation below 5%. Moreover, the recovery value for blind measurements was determined to be 1.08. Additionally, the system enabled the quantification of CRP in human blood serum with a 10 ng/mL LOD. Ultimately, the newly developed LFD device is functional and highly sensitive for CRP samples. However, it was emphasized that a sample pre-treatment step is mandatory to achieve the assay maximum potential.

Lateral Flow Devices (LFDs) sind kostengünstige, einfache und effiziente Instrumente, die eine leistungsstarke Diagnostik am Point-of-Care (POC) des Patienten ermöglichen. Dezentralisierte Gesundheitslösungen wie LFDs werden benötigt, um Pandemien einzudämmen und Behandlungen unabhängig vom Standort zu unterstützen. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines neuartigen elektrochemischen LFDs für die Quantifizierung von C-reaktivem Protein (CRP), einem wichtigen Marker für Entzündungen, vorgestellt. Der Nachweis erfolgt durch einen Sandwich-Assay mit auf einer Nitrozellulosemembran immobilisierten Fänger-Antikörpern und mit einem Enzymmarker konjugierten Nachweis-Antikörpern. Ein erstes Proof-of-Concept des Systems bestätigte das Funktionsprinzip des Assays und half bei der Bestimmung der leistungsentscheidenden Parameter. Auf Grundlage dieser Informationen wurde die Hardware des Assays verbessert, um einheitliche und zuverlässige Messbedingungen zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wurden ein elektrochemischer Einwegsensor und ein tragbares LFD-Gehäuse sorgfältig entworfen und produziert. Außerdem wurden die LFD-Komponenten geprüft, um die Kombination zu finden, die die besten Versuchsbedingungen bietet. Anschließend wurde der Immunoassay gründlich untersucht. Die Zusammensetzung sowohl des Puffers als auch des Blockierungsmittels wurde untersucht und optimiert. Darüber hinaus wurde jedes Konjugatreagenz untersucht und entsprechend angepasst. Darüber hinaus wurden drei LFD-Detektionsmethoden verglichen, wobei sich herausstellte, dass die elektrochemische Methode für diese Anwendung geringere Fehler, eine bessere Sensitivität und einen größeren dynamischen Bereich aufweist. Schließlich wurde das fertige Gerät zusammengebaut und mit drei verschiedenen Ansätzen für die Verwendung des Konjugats getestet. Das wässrige Mischen des Konjugats mit der Probe ergab die zuverlässigsten und empfindlichsten Ergebnisse mit einer Nachweisgrenze (engl. „limit of detection“, LOD) für CRP in Puffer von 5 ng/ml und einem durchschnittlichen Variationskoeffizienten von weniger als 5 %. Darüber hinaus wurde der Wiederfindungswert für Blindmessungen mit 1,08 ermittelt. Darüber hinaus ermöglichte das System die Quantifizierung von CRP in menschlichem Blutserum mit einer LOD von 10 ng/mL. Letztendlich ist das neu entwickelte LFD-Gerät funktionell und hochempfindlich für CRP-Proben. Es wurde jedoch betont, dass ein Probenvorbehandlungsschritt obligatorisch ist, um das maximale Potential des Assays zu erreichen.