Synthesis of sulfated O- and C- galactosides and -amines development of novel enzyme substrates to indicate mucopolysaccharidosis in newborn

Abstract

Mukopolysaccharidosen (MPS) werden zur Gruppe der lysosomalen Speicherkrankheiten gerechnet. Diese Stoffwechselerkrankungen werden im Allgemeinen autosomal rezessiv vererbt, erlauben aber meist keine symptomatische Indikation bei der Geburt. Der Mangel an einem bestimmten lysosomalen Enzym führt zur stetigen Anreicherung der jeweiligen metabolischen Zwischenprodukte innerhalb des Lysosoms, das in weiterer Folge die Funktion der Zelle beeinträchtigt. Nicht frühzeitig erkannt, führt dies bald zur Ausbildung erster Symptome, denen meist bereits irreparable Schäden zugrunde liegen und die im weiteren Verlauf unweigerlich zu Folgeschäden führen. Die Entwicklung vielversprechender neuer Therapieansätze für eine wachsende Zahl von MPS, macht die Früherkennung dieser Leiden zur Verbesserung der Prognose immer wichtiger. Daher ist das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung neuartiger Enzymsubstrate, die die neonatale Diagnose der Mukopolysaccharidoseformen MPS IVa und MPS VI ermöglichen. Letztendlich sollen diese Eingang in bereits etablierte Neugeborenen-Screening Programme finden, die auf der Auswertung von Trockenblutkarten beruhen. Ein vielversprechendes, neuartiges Substrat-Design zugeschnitten auf die Enzyme GALNS und ARSB wurde entwickelt. Diese lysosomalen Enzyme spielen eine wichtige Rolle im andauernden Um- und Abbau von Glykosaminoglykanen wie Dermatan-, Ketaran- oder Chondroitinsulfat. Daher weisen auch die künstlichen Substrate Galactose- bzw. N-Acetylgalactosamin-Grundkörper auf, die Sulfatgruppen in Position 4 (MPS VI) bzw. in Position 6 (MPS IVa) tragen. Wenngleich eine gewisse Ähnlichkeit zu diesen Polysacchariden notwendig ist um eine Annahme durch das Enzym zu gewährleisten, müssen die Zielsubstanzen zusätzliche Gruppen enthalten die eine Detektion mittels Tandem-Massenspektrometrie erlauben. Die Anwendung einer Click-Reaktion soll die separate Optimierung dieses Bereichs ermöglichen, ohne den biochemisch relevanten Teil durch eventuell unvereinbare Rektionsbedingungen zu gefährden. Um die unerwünschte Spaltung der glykosidischen Bindung durch weitere anwesende Enzyme während der Inkubation oder durch Ionisation im MS zu unterbinden, sollen C-Glykoside aufgebaut werden. Zusätzlich sieht das Substrat-Design neben der regioselektiven Sulfatierung auch die Installation einer N-Acetyl Funktionalität in Position 2 des Galactosids vor, um eine möglichst gute molekulare Erkennung zu gewährleisten. Um diesen synthetischen Anforderungen begegnen zu können wurden sie auf drei separate Strategien verteilt die eine stufenweise Annäherung erlauben. Somit wurden gewöhnliche Galactoside (O/O) neben C-glycosylierten (C/O) sowie stickstoffhaltigen Verbindungen (C/N) synthetisiert.

Mucopolysaccharidosis (MPS) belong to a broader group of lysosomal storage diseases. These metabolic disorders generally exhibit an autosomal recessive pattern of inheritance but usually show no indicating symptoms at birth. Deficiency of a particular lysosomal enzyme causes gradual accumulation of the corresponding metabolic intermediates within the lysosome that eventually challenge functionality of the cell. If not recognized early enough, first symptoms will become apparent that already portend irreparable damage certainly leading to further complications sooner or later. As promising treatments are being developed for an increasing number of mucopolysaccharidosis, an early initial diagnosis of these conditions gains importance to maximize benefits of the applied therapy. Therefore the aim of this work is to develop novel enzyme substrates by which certain types of mucopolysaccharidosis (MPS IVa & VI) can already be indicated in newborn. Eventually the final goal is their implementation into already existing diagnostic neonatal screening routines using enzyme essays that are based on application of dried blood spots (DBS) contained on Guthrie cards. Promising new substrate designs tailored for the enzymes of interest (GALNS, ARSB) were developed. As these lysosomal enzymes play a central role in the constant depletion and alteration of glycosaminoglycan chains (GAG) like dermatan, ketaran or chondroitin sulfate also the artificial substrates contain a galactose or N-acetylgalactosamin moiety that appears to be sulfated at position 4 (MPS VI) or 6 (MPS IVa) respectively to mimic the natural substrates. Although a certain resemblance to these polysaccharides is necessary to be accepted by the enzyme, the aspired structures must also contain motifs that allow their detection using tandem mass spectrometry. By implementing Click chemistry it’s possible to optimize this part separately so that the biochemical relevant domain isn’t jeopardized by possibly incompatible reaction conditions. To minimize unwanted cleavage of the glycosidic bond caused by other enzymes present in the media or while ionization during MS measurement the introduction of a c-glycosidic joint seems reasonable. Besides that the target structures demand not only regioselective sulfation but also a way to install an N-acetyl moiety at position 2 of the galactoside scaffold to provide an as good molecular recognition as possible. To cope with the demands of this synthetic assignment, the task was split into three separate strategies that allow a continuous enrichment of know how. Prototypes like ordinary (O/O) or C-glycosylated galactosides (C/O) as well as compounds that actually contain the aspired nitrogen functionality (C/N) were synthesized.