Controlling the third dimension : Critical quality parameters of static and dynamic spheroid cultures for drug screening applications

Abstract

Three-dimensional (3D) multicellular spheroid systems, mimicking human physiology and diseases, are a promising solution to close the gap between pre-clinical trials and human in vivo scenarios. Implementing 3D spheroids into mainstream pharmaceutical procedures is considered to achieve representative test results leading to reduced development costs and drug attrition rates. Despite the rise of spheroid culture in the last decades, the lack of reproducibility and variations in screening procedures influence drug safety and efficacy outcomes, impeding a full incorporation of 3D cell culture systems into current drug discovery programs. In this thesis, critical spheroid parameters are identified, evaluated, and controlled regarding their impact on pre-clinical drug screening results. Quality factors as spheroid morphology, viability, microarchitecture, functionality, drug sensitivity, and compound penetration are assessed by a range of colorimetric, microscopic, and spectroscopic techniques. To validate the spheroid technology in an industrial setting, a) the potential therapeutic effect and clearance of a pre-clinical nanodrug are investigated in a fully characterized static 3D liver spheroid culture model, and b) a versatile dynamic high-throughput spheroid-on-a-chip system is established to manipulate and screen spheroid size effects for anti-cancer drug testing and paracellular compound transport across the blood-brain barrier. Substantial changes in viability assay precision, as well as in IC50 values between spheroids of different ages (e.g., 118% between 3- day and 12- days post-seeding) and spheroid sizes (e.g., 160% between spheroid of 900 μm and 90 μm in diameter), can be observed and demonstrate the importance of validating quality parameters of 3D spheroids to select the most appropriate condition for each pharmaceutical screening routine. To achieve these objectives, valuable insights for spheroid cultivation and screening procedures are obtained to increase data robustness in early-stage studies and ultimately enhance significance in biomedical and pre-clinical research.

Dreidimensionale (3D) Sphäroidmodelle ermöglichen durch ihre biologischen Eigenschaften Physiologie und Funktionalität von menschliche Gewebe außerhalb des Körpers zu reproduzieren. Dadurch können vielversprechende Prognosen zu neuen Therapiemöglichkeiten getroffen werden. Eine breite Anwendung von 3D-Sphäroiden in gängige pharmazeutische Prozesse verspricht daher eine frühere Selektierung von potenziellen Wirkstoffkandidaten sowie eine Reduktion der ohnehin schon sehr hohen Entwicklungskosten und Ausfallquoten in der Medikamentenentwicklung. Trotz des Aufschwunges der Sphäroidtechnologie in den letzten Jahrzehnten, beeinflussen vor allem mangelnde Reproduzierbarkeit die Ergebnisse unterschiedlichster Studien erheblich wodurch eine vollständige Implementierung dieser Zellmodelle in gängige Testprogramme verhindert wird.In dieser Arbeit werden daher kritische Sphäroidparameter identifiziert und hinsichtlich ihres Einflusses auf Resultate von präklinischen Wirkstoffscreenings untersucht. Qualitätsfaktoren wie Sphäroidmorphologie, Viabilität, Mikroarchitektur, Funktionalität, Arzneimittelempfindlichkeit und -transport werden durch eine Reihe kolorimetrischer, mikroskopischer und spektroskopischer Techniken geprüft und bewertet. Um die Sphäroid-Technologie in einem industriellen Umfeld zu validieren, werden a) die möglichen therapeutischen Wirkungen sowie die Clearance eines präklinischen Nanotherapeuthikums in einem charakterisierten statischen 3D-Leber-Sphäroid-Kulturmodell untersucht und b) ein dynamisches Sphäroid-on-a-Chip-System etabliert, um Sphäroidgrößeneffekte für Krebsmedikamententests und den parazellulären Transport von Wirkstoffen über die Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. Signifikante Unterschiede in der Präzision von Zellviabilitätsassays als auch in den IC50-Werten zwischen Sphäroiden unterschiedlichen Alters (z. B. 118% zwischen 3 und 12 Tagen nach Aussaat) und Größen (z. B. 160% zwischen 900 μm und 90 μm Durchmesser) kann verifiziert werden und zeigt die Bedeutsamkeit kritische Qualitätsparameter von Sphäroiden zu validieren. Zu diesem Zweck werden in dieser Dissertation wertvolle Erkenntnisse zur Charakterisierung von Sphäroiden vorgestellt, um die Robustheit komplexer Zellsysteme zu erhöhen und deren Bedeutung in der präklinischen Forschung zu steigern.