Statistical analysis of biomolecular clustering and oligomerization

Abstract

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (Single Molecule Localization Microscopy, SMLM) umgeht die Auflösungsgrenze herkömmlicher Lichtmikroskopie indem die Signale einzelner Fluorophore zeitlich separiert werden, sodass die entsprechenden Punktbildfunktionen nicht mehr überlappen. Durch Fitten der Einzelmolekül-Signale kann die Position jedes einzelnen Emitters mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden. Die erhaltenen Koordinaten von tausenden aufgenommenen Einzelbildern werden kombiniert und ergeben eine rekonstruierte Lokalisationskarte. Dies ermöglicht es, die Anordnung von Biomolekülen in deren nativer Umgebung, der Zelle, in bisher unvorstellbarem Detail zu erforschen. Bei SMLM-Methoden wird die erreichbare Auflösung durch die Lokalisierungsgenauigkeit bestimmt. In den letzten Jahren lag der Fokus einiger Forschungsgruppen darauf, SMLM unter Tieftemperaturen durchzuführen (cryo-SMLM). Durch die höhere Anzahl an Photonen per Fluorophor, die dabei erreicht werden kann, sowie die Unterbindung von residualer Diffusion der Moleküle kann die Lokalisierungsgenauigkeit noch weiter verbessert werden. Eine Herausforderung besteht jedoch darin, dass dabei auch die Fluorophor-Dipole fixiert sind: Eine laterale Verschiebung der Intensitätsmaxima führt zu einer Verzerrung der Lokalisierung. In dieser Dissertation zeige ich wie ein einfacher astigmatischer Bildgebungsansatz diese Verzerrung vermeiden kann, während die Lokalisierungsgenauigkeit die Cramér-Rao-Schranke erreicht. Das bisherige Hauptaugenmerk von SMLM-Analysen lag auf der genauen Lokalisierung von Fluorophoren. Der natürliche nächste Schritt betrifft die qualitative und quantitative Interpretation der Lokalisationskarten und deren biologische Relevanz. Solch eine Interpretation ist herausfordernd, da durch Fluorophor-Blinken dasselbe Molekül öfters detektiert werden kann, was zu scheinbaren Lokalisations-Clustern führt. Andere Moleküle wiederum werden aufgrund unzureichender Markierungs- oder Detektionseffizienz übersehen. Als Konsequenz erscheint die erhaltene Lokalisationskarte entstellt. In dieser Dissertation stelle ich zwei verschiedene Methoden vor, die es ermöglichen echtes molekulares Clustering von Artefakten durch Mehrfachdetektion zu unterscheiden. Als Erstes erlaubt eine umfassende Charakterisierung des Fluorophor-Blinkverhaltens kombiniert mit Monte-Carlo-Simulationen eine robuste Evaluierung von Lokalisationskarten bezüglich molekularem Clustering. Zweitens erreicht ein neuer Ansatz, welcher ein Molekül kompetitiv mit zwei verschiedenen Farbstoffen markiert, eine Beurteilung des molekularen Clustering komplett unabhängig vom Fluorophor-Blinkverhalten. Dies ermöglicht es, biomolekulares Clustering bis hinunter auf das Niveau von Dimeren zuverlässig und mit hoher Sensitivität zu detektieren. Im Falle von cryo-SMLM besteht eine weitere Möglichkeit Artefakte durch Mehrfachdetektion zu umgehen: Bei Tieftemperaturen stellen die fixierten Dipolorientierungen ein einzigartiges Merkmal dar, welches ausgenützt werden kann, um Lokalisationen den jeweiligen Fluorophoren zuzuordnen. Gemeinsam mit Ansätzen zur Mittelung von Eigenschaften über viele Partikeln (particle averaging) kann die exakte Anordnung von Molekülen in Oligomer-Komplexen mit einer Größe von wenigen Nanometern bestimmt werden. Hier wird eine Methode für präzises Bestimmen der Größe von Oligomer-Strukturen vorgestellt. Insgesamt kann somit eine umfassende Analyse und Bestimmung von biomolekularen Verteilungen und Anordnungen in der Zelle erreicht werden.

Single molecule localization microscopy (SMLM) circumvents the diffraction limit of light by separating the signals from individual fluorophores in time, so that the corresponding point spread functions do not overlap anymore. Fitting the single molecule signals allows to determine the position of each emitter with nanometer precision. The obtained coordinates from thousands of recorded frames are combined, yielding a reconstructed localization map. Thus, the arrangement of biomolecules in their native environment can be investigated in unprecedented detail. In SMLM, the localization precision limits the achievable resolution. In the recent years, several research groups focused their interest onto SMLM performed under cryogenic conditions (cryo-SMLM). In cryo-SMLM, a higher photon yield per fluorophore and the prevention of residual diffusion allow to improve the localization precision beyond previous limits. One challenge, however, are fixed fluorophore dipole orientations: A lateral shift of the intensity peak easily leads to a localization bias. Here, I show how a simple astigmatic imaging approach avoids this bias, while achieving a precision at the Cramér-Rao bound. While the main focus of SMLM analysis up to now has been the precise localization of the fluorophores, the natural next step concerns qualitative and quantitative interpretation of the localization maps and their biological relevance. Such an interpretation is challenging, as the same molecule of interest may be detected multiple times due to blinking, leading to apparent localization clusters. On the other hand, molecules may be missed due to insufficient labeling or detection efficiency. In consequence, the determined localization map appears distorted. In this thesis, I present two different methods for distinguishing true molecular clustering from overcounting artifacts. First, a comprehensive characterization of fluorophore blinking behavior combined with Monte Carlo simulations allows for robust evaluation of localization maps with respect to true molecular clustering. Second, a novel approach based on targeting the same molecule of interest with two different labels competitively achieves an assessment of molecular clustering completely independent of fluorophore blinking. Thus, biomolecular clustering can be reliably detected with high sensitivity down to the level of dimers. In case of cryo-SMLM, another possibility for circumventing overcounting artifacts arises: At cryogenic temperatures, the fixed fluorophore dipole orientations present a unique characteristic, which can be exploited in order to assign localizations to individual fluorophores. Combined with particle averaging approaches, the exact arrangement of molecules in oligomeric complexes of a few nanometers in size can be determined. A method for precise sizing of oligomeric structures is presented in this thesis. Taken together, a comprehensive analysis and description of biomolecular distributions and arrangements in the cell can be achieved.