Systematic analysis of a DNA origami based biointerface for T cell activation

Abstract

Das Verständnis der T-Zell-Aktivierung auf molekularer Ebene erfordert eine präzise räumliche Organisation von Signalliganden, was mit konventionellen biochemischen Ansätzen schwer zu erreichen ist. Diese Dissertation untersucht die Diskrepanz zwischen zuvor berichteten erfolgreichen T-Zell-Aktivierungen mittels DNA-Origami-Nanostrukturen und unserer Unfähigkeit, diese Ergebnisse mit vergleichbaren Systemen zu reproduzieren. Wir führten systematische Analysen durch, um potenzielle Faktoren zu identifizieren, die die T-Zell-Aktivierung in unserem experimentellen Aufbau einschränken. Die Qualität unterstützter Lipiddoppelschichten (SLBs) wurde zunächst durch verschiedene Glasreinigungsprotokolle, Temperaturbedingungen während der Vesikelinkubation und Rinderserumalbumin (BSA)-Passivierungsbehandlungen bewertet, wobei die NK_p30-Proteindiffusion als empfindlicher Qualitätsindikator diente. Alle Methoden lieferten konsistente Diffusionskoeffizienten (0,9-1,2 μm^2/s), was die SLB-Qualität als limitierenden Faktor ausschließt. Wir optimierten dann die Cholesterin-DNA-Verankerung von DNA-Origami-Plattformen durch Variation der Konzentrationen und Inkubationszeiten. Dabei zeigte sich, dass kürzere Inkubationen (15 Minuten gegenüber 60 Minuten) sowohl die Oberflächendichte (0,30-0,48 gegenüber 0,15-0,27 Moleküle/μm^2) als auch die Diffusionskoeffizienten (0,27-0,29 gegenüber 0,17-0,25 μm^2/s) signifikant verbesserten. Eine Cholesterin-DNA-Konzentration von 19-48 nM erwies sich als ausreichend, um die Plattformbindung effektiv zu sättigen, wodurch höhere Konzentrationen als unnötig identifiziert wurden. Trotz dieser Optimierungen konnten DNA-Origami-Plattformen mit monovalentem Streptavidin (mSA) und biotinylierten Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplexen (pMHC) keine robuste T-Zell-Aktivierung induzieren (<18%). Weitere Untersuchungen mit vereinfachten Konstrukten zeigten, dass His-markierte pMHC ohne mSA-Intermediäre physiologisch relevante Aktivierungsniveaus erreichten (70-100%), während cholesterin-DNA-verankerte mSA-pMHC- und PNA-H57-Konstrukte sowie His-markierte mSA-pMHC eine mittlere Aktivierung zeigten (35-51%). Bemerkenswerterweise reduzierte bei hohen ICAM-1/B7-Konzentrationen die kompetitive Bindung die Oberflächendichte von His-markierten pMHC aufgrund gemeinsamer His-Tag-Verankerungsmechanismen erheblich. Diese Ergebnisse unterstreichen die kritische Bedeutung der molekularen Architektur in künstlichen T-Zell-Aktivierungssystemen und identifizieren mSA und biotinyliertes pMHC als potenzielle limitierende Faktoren in unseren DNA-Origami-Plattformen, was wertvolle Erkenntnisse für die zukünftige immunologische Forschung mit biomimetischen Membransystemen liefert.

Understanding T cell activation at the molecular level requires precise spatial organization of signaling ligands, which is challenging to achieve with conventional biochemical approaches. This thesis investigates the discrepancy between previously reported successful T cell activation using DNA origami nanostructures and our inability to reproduce these results with comparable systems. We conducted systematic analyses to identify potential factors limiting T cell activation in our experimental setup. The quality of supported lipid bilayers (SLBs) was first assessed through various glass cleaning protocols, temperature conditions during vesicle incubation, and bovine serum albumin (BSA) passivation treatments, with NK_p30 protein diffusion serving as a sensitive quality indicator. All methods yielded consistent diffusion coefficients (0.9-1.2 μm^2/s), ruling out SLB quality as a limiting factor. We then optimized cholesterol-DNA anchoring of DNA origami platforms by varying concentrations and incubation times, revealing that shorter incubations (15 minutes versus 60 minutes) significantly improved both surface density (0.30-0.48 versus 0.15-0.27 molecules/μm^2) and diffusion coefficients (0.27-0.29 versus 0.17-0.25 μm^2/s). 19-48 nM cholesterol-DNA concentration was found to effectively saturated platform binding, identifying the cholesterol-DNA concentration above it as unnecessary. Despite these optimizations, DNA origami platforms carrying monovalent streptavidin (mSA) with biotinylated peptide -Major-Histocompatibility Complex (pMHC) consistently failed to induce robust T cell activation (<18%). Further investigations with simplified constructs revealed that His-tagged pMHC without mSA intermediaries achieved physiologically relevant activation levels (70-100%), while cholesterol-DNA-anchored mSA-pMHC- and PNA-H57 constructs, as well as His-tagged mSA-pMHC, showed intermediate activation (35-51%). Notably, at high ICAM-1/B7 concentrations, competitive-binding significantly reduced His-tagged pMHC surface density due to shared His-tag anchoring mechanisms. These findings highlight the critical importance of molecular architecture in artificial T cell activation systems and identify mSA and biotinylated pMHC as potential limiting factor in our DNA origami platforms, providing valuable insights for future immunological research using biomimetic membrane systems.