Analysis of membrane proteins organization and function using micropatterning

Abstract

Die Plasmamembran ist eine dynamische und komplexe Struktur, die für zahlreiche zelluläre Prozesse wie Signalübertragung, Adhäsion und molekularen Transport von entscheidender Bedeutung ist. Diese Funktionen werden hauptsächlich durch Membranproteine vermittelt – sowohl durch ihre wechselseitigen Interaktionen als auch durch ihre Assoziation mit umgebenden Lipiden. Die Untersuchung der Aktivität und der nanoskaligen Organisation von Membranproteinen in lebenden Zellen stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung dar. Auch modernste Bildgebungstechniken können schnelle, dynamische Prozesse in der Membran nur eingeschränkt erfassen. In dieser Arbeit wird „Protein Micropatterning“ – eine Methode, die eine räumlich kontrollierte Immobilisierung von Membranproteinen in lebenden Zellen ermöglicht – in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um zwei unterschiedliche Fragestellungen zu untersuchen.Zunächst untersuchten wir die nanoskalige Lipidumgebung verschiedener Transmembranproteine. Durch Immobilisierung der Proteine in definierten Dichten in der Plasmamembran lebender Zellen und durch Messung der Mobilitätsreduktion von Lipid-Tracern bestimmten wir ihren hydrodynamischen Radius. In diesem Assay würde eine enge Anlagerung von Lipiden mit verringerter Fluidität als vergrößerter Radius des Proteins nachweisbar sein. Bei drei von vier getesteten Proteinen stimmten die experimentell bestimmten Größen mit den aus der Proteinstruktur berechneten Größen überein, wodurch wir die Existenz einer Schicht immobilisierter Lipide ausschließen konnten. Aus diesen Ergebnissen schlossen wir, dass solche stark assoziierten Lipide kein universelles Organisationsschema der Plasmamembran darstellen.Zweitens entwickelten wir einen Live-Cell-Assay, um die Kinaseaktivität des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 3 (FGFR3) zu quantifizieren. Fluoreszenzmarkierter FGFR3 wurde innerhalb definierter Muster immobilisiert und angereichert, und seine Aktivierung wurde über die Rekrutierung des nachgeschalteten Signaltransduktors GRB2 (Growth Factor Receptor Bound 2) verfolgt. Mit diesem Assay verglichen wir die Aktivität von Wildtyp-FGFR3 und vier krankheitsassoziierten Mutanten nach Stimulation mit den Liganden FGF1 und FGF2. Alle Mutanten zeigten eine erhöhte basale Aktivität und unterschiedlich starke Reaktionen bei der Zugabe von Liganden. Im Gegensatz zu früheren Studien misst diese Methode die Rezeptoraktivität gezielt an der Plasmamembran.Zusammen zeigen unsere Studien das Potenzial von „Protein Micropatterning“ zur Untersuchung der Funktion und Organisation von Membranproteinen in lebenden Zellen und liefern neue Erkenntnisse über Lipid-Protein-Wechselwirkungen und Rezeptor-Signalwege.

The plasma membrane is a dynamic and complex structure essential for numerous cellular processes, including signaling, adhesion, and molecular transport. These functions are primarily mediated by membrane proteins through their mutual interactions and their association with surrounding lipids. However, studying the activity and nanoscale organization of membrane proteins in living cells remains challenging due to the limitations of current imaging techniques to capture fast, dynamic processes occurring in the membrane. This thesis employs protein micropatterning—a method that allows spatially controlled immobilization of membrane proteins in live cells—in combination with fluorescence microscopy to address two distinct research questions.First, we examined the nanoscale lipid environment surrounding different transmembrane proteins. By immobilizing proteins at defined densities in the live-cell plasma membrane and monitoring the mobility reduction of lipid tracers, we determined their apparent in-plane hydrodynamic radius. In this assay, tight adhesion of lipid layers with reduced fluidity would be detectable as an increased radius of the protein of interest. For three out of four proteins tested, the experimental data matched structural expectations and did not support the presence of a shell of immobilized lipids, suggesting that such boundary lipids are not a universal feature of plasma membrane organization.Second, we developed a live-cell assay to quantify the kinase activity of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3). Fluorescently labeled FGFR3 was immobilized and enriched within defined patterns, and receptor activation was monitored via the recruitment of its downstream signal transducer growth factor receptor bound 2 (GRB2). Using this assay, we compared the activity of wild-type FGFR3 and four disease-associated mutants upon stimulation with FGF1 and FGF2 ligands. All mutants exhibited increased basal activity, with variable responses to ligand addition. Notably, discrepancies with previous studies highlight the importance of measuring receptor activity specifically at the plasma membrane.Together, these studies demonstrate the unique ability of micropatterning approaches to dissect membrane protein function and organization in living cells, providing new insights into lipid–protein interactions and receptor signaling.