Characterization of protein-protein interactions at the cell membrane using nanopatterned surfaces

Abstract

Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen kann in der Membran lebender Zellen dadurch gemessen werde, dass diese mit fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen markiert und abgebildet werden. Da bei der Auswertung des Überlapps der gemessenen Signale mannigfaltige Probleme auftreten, wurde von unserer Gruppe vorgeschlagen, ein Protein in einem vorgegbenen Muster anzuordnen und das Vorkommen und das Diffusionsverhalten des Zweiten mit dem Muster des Ersten zu vergleichen. Die Erstellung dieser Muster erfolgt über eine Bindung über Antikörper an eine unterliegende Struktur aus Streptavidin, die mittels Mikrokontakt-Stempeldruck hergestellt wurde. Technisch waren die Standardverfahren hierzu nur in der Lage, Strukturen zu generieren, die eine Größenordnung über den vermuteten funktionellen Bereichen in der Zellmembran liegen. Zur Miniaturisierung auf Größen von 200 nm und darunter ist es nötig neue Materialien zu verwenden und Protokolle zu optimieren. In meiner Diplomarbeit studierte und charakterisierte ich Nansotrukturen, welche über POSS Materialien erzeugt wurden, mittels moderner Mikroskopitechniken wie z.B. TIRF Mikroskopie, hochaufgelöste Einzelmolekül Mikroskopie, sowie AFM. Schließlich führte ich präliminäre Experimente an lebenden Zellen durch.

Protein-protein interaction in live cell membranes can be shown by labelling the proteins of interest and mapping the distribution of the respective fluorescent signal in the membrane. The difficulties of analyzing colocalization experiments can be circumvented by arranging one of the proteins as bait in a well-defined pattern in the cell membrane and measuring and comparing the abundance and diffusion characteristics of the second protein in bait-rich and bait-depleted areas. To create those patterns the bait protein is immobilized by antibodies that are linked to Streptavidin, which is deposited in an underlying structure using soft lithography. The standard protocols for this technique allow only the creation of feature sizes which are at least one order of magnitude larger than the supposed size of functional domains in the cell membrane. To miniaturize the size of patterns to widths of 200 nm and below great efforts in lithography are required as substrates have to be chosen more carefully and novel stamp materials have to be used. In my diploma thesis I studied and characterized nanopatterns generated by novel POSS materials using advanced microscopy technique such as TIRF, single molecule superresolution microscopy and AFM. Finally, I applied the system for preliminary experiments on live cells.