Korrelative Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung von Autophagie

Abstract

Heutzutage sind Wissenschaftlern viele verschiedene bildgebende Verfahren verfügbar, dennoch ist es nach wie vor eine Herausforderung diese adäquat zu kombinieren um biologische Fragestellungen ganzheitlich zu beantworten und den gesamten relevanten Auflösungsbereich zu nutzen. Die Kombination verschiedener bildgebender Verfahren wird Correlative Imaging genannt: Informationen über die zu untersuchende Probe werden durch mindestens zwei komplementäre Verfahren gesammelt, die eine ganzheitliche Ansicht der Probe erzeugen. Dadurch können komplementäre Informationen über Struktur, Dynamik, Funktion und molekulare Komposition derselben Probe geliefert werden. Das Ziel dieses Projektes war es, eine multimodale korrelative Imaging Pipeline zu entwickeln und Autophagie in Pflanzen zu untersuchen. Mit dieser Pipeline wurde in-vivo proteinspezifische Information über Autophagosome in wachsenden Wurzelspitzen von Arabidopsis in Kontext mit deren Ultrastruktur gesetzt. Die Pipeline ermöglicht es, einen Überblick über Autophagosome in deren natürlicher 3D Umgebung zu erhalten (Autophagieatlas von Wurzeln), deren zellspezifisches Auftreten zu beurteilen und in Folge bis zur Ultrastruktur heran zu zoomen um die Verteilung innerhalb der Zellen mit einer Nanometer-Genauigkeit zu visualisieren, um deren Ursprung und das Areal der Biogenese zu erforschen. Um den Autophagie Atlas zu visualisieren wurde konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie, Lichtscheibenmikroskopie und micro-Computertomographie (CT) genutzt. Der zelluläre Kontext der Autophagosomen wurde durch Verwendung von Transmissionselektronenmikroskopie dargestellt. Hochdruckgefrieren wurde genutzt um den möglichst natürlichen Zustand der Wurzel direkt nach dem in-vivo Imaging zu fixieren und zu präservieren. Die Entwicklung dieses multimodalen Workflows erforderte die Optimierung der Probenvorbereitung um Kompatibilität zwischen den verschiedenen Techniken zu gewährleisten. Dieser neuartige Workflow, der in dieser Arbeit präsentiert wird, ermöglicht es in eine intakte Probe heranzuzoomen angefangen von ihrer gesamten 3D Morphologie bis hin zu ihrer Ultrastruktur was genutzt werden kann um eine Vielzahl von gegenwärtigen Fragestellungen zu untersuchen.

Many imaging modalities are available to scientists nowadays, nevertheless it remains a challenge to combine them adequately to answer the biological research question of interest holistically and resolve all relevant length scales. The combination of modalities for the examination of a single specimen is termed correlative imaging: Information about the specimen is gathered with two or more complementary modalities which create a composite view of the sample. This view can provide complementary information about structure, dynamics, function and molecular composition of a single specimen. My main goal was to develop a multimodal correlative imaging pipeline to study autophagy in plants. With this pipeline, invivo protein-specific information about autophagosomes within growing Arabidopsis root tips was placed into its ultrastructural context. The pipeline allows to acquire an overview of autophagosomes within their native 3D environment (autophagy atlas of roots), assess their cell-specific occurrence and zoom in on their ultrastructural distribution within single cells with nanometer precision to study their origin and area of biogenesis. To visualize the autophagy atlas confocal spinning disk microscopy, light sheet microscopy and Micro-Computed Tomography (CT) were used. The cellular context of the autophagosomes was visualized using Transmission Electron Microscopy. High-pressure freezing was used to fix and preserve the near-native state of the root right after in-vivo imaging. The development of this multimodal workflow required optimization of sample preparation to ensure compatibility between the techniques. The novel workflow presented in this thesis allows to zoom in on an intact sample starting from its overall 3D morphology down to its ultrastructural composition, which can be used to explore a multitude of current research questions.