Development of carbonyl-sensing assays for the application in fluorescence-activated droplet sorting

Abstract

Enzyme haben aufgrund ihre unvergleichlichen Selektivität und Versatilität Chemiker seit Beginn an verleitet, ihren katalytischen Nutzen zu erforschen. Sie bieten eine effiziente und umweltfreundliche Alternative zu herkömmlichen organischer Synthesemethodik. Vor allem durch die zunehmende Identifizierung neuer Biokatalysatoren mittels Einsatzes von Bioinformatik und weitrechenden Entwicklungen im Protein-Engineering Bereich, hat ihre Verwendung einen stetig wachsenden Platz in der katalytischen Landschaft eingenommen. Mithilfe von gerichteter Evolution, in welcher zufällige Mutationen in die Struktur von Proteinen eingebaut werden, können Chemiker noch unerforschte Reaktionen realisieren. Die immense Anzahl an Enzymvarianten, die durch randomisierte Mutation erzeugt werden erfordert jedoch ausgefeilte Selektions-Werkzeuge. Neuartige Ultra-Hochdurchsatz-Screening-Systeme ermöglichen die Untersuchung von Bibliotheken mit bis zu 10^7 Enzymvarianten durch Einsatz von mikrofluidischen Geräten und hochempfindlichen Fluoreszenz-Assays. Zu diesen Ansätzen gehört das Fluorescence-Activated Droplet Sorting (FADS), worin einzelne Zellmutanten in pL-großen wässrigen Tröpfchen mit perfluorierten Medien umschlossen werden. Gleichzeitig interagieren miteingeschlossene fluorogene Assay-Komponenten mit dem gewünschten enzymatisch-hergestellten Produkt und ermöglichen so einen empfindlichen Nachweis der gewünschten Reaktionen mittels laserinduzierter Fluoreszenz (LIF). Durch die Verwendung von Tensiden wird die Koaleszenz der Tröpfchen verhindert, und die Messwerte können direkt mit der individuellen enzymatischen Aktivität in Zusammenhang gebracht werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine hohe Wasserlöslichkeit der Testkomponenten - korreliert mit logD-Werten - eine Voraussetzung ist, um den Transport der fluoreszierenden Produkte zwischen einzelnen Tröpfchen durch die kontinuierliche Phase zu beeinträchtigen. Ziel dieser Arbeit war es, analytische Werkzeuge zu entwickeln, die eine schnelle Evaluierung von Bibliotheken mit gerichteter Evolution unter Verwendung des FADS-Ansatzes für zwei promiskuitive Enzyme, die Carbonsäurereduktase (CAR) und die Squalen-Hopenzyklase (SHC), ermöglichen würden. In beiden Fällen führten die geplanten enzymatischen Umwandlungen zu Carbonylverbindungen. Diese waren entweder inhärent fluoreszent oder wurden durch nachgeschaltete Konjugation mit geeigneten fluorogenen Reportern nachgewiesen. Zu Beginn wurde die SHCs als neues biokatalytisches System in der Forschungsgruppe etabliert Hierzu wurde eine Reihe bekannter Citronellal-Derivate synthetisiert, um die katalytische Promiskuität einiger SHC Mutanten für die enzymatische Prins-Reaktion zu eruieren. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde versucht die Brønsted-saure katalytische Maschinerie für eine analoge Cyclisierung geeigneter fluorogener Arylnukleophile in einer formalen Friedel-Crafts-Acylierung (FCA) nutzbar zu machen. Aufgrund der Inkompatibilität der Enzyme für diese nicht-natürliche Transformation wurde eine Mutationsstudie mittels gerichteter Evolution beabsichtigt. Die Identifizierung von positiven Mutanten sollte mittels Ultra-Hochdurchsatz-Screenings durch Implementierung eines carbonylselektiven Sensors möglich gemacht werden. Hierbei wurden zwei verschiedene Ansätze unter Verwendung bereits etablierter carbonylspezifischer Assay-Tools auf der Basis von NBD- (7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol) und ABAO- (2-Aminobenzamidoxim) Reagenzien erforscht und so angepasst, dass sie in FADS-Systemen anwendbar gemacht werden können. Dies wurde durch den Einbau hydrophiler Gruppen erreicht, die einen möglichen Austritt über die Tröpfchengrenzfläche minimieren. Die synthetisierten wasserlöslichen Derivate wiesen nachweislich unverändert positive optische und kinetische Eigenschaften auf. Ergänzend zur Entwicklung der chemischen Carbonyl-Assays wurde an der TU Wien ein individuell konfigurierbares FADS-System etabliert. Der Aufbau des Instruments beinhaltete die optische und optomechanische Hardware-Montage, die Installation des mikrofluidischen Durchflussreglers, die Herstellung der mikrofluidischen Chips sowie das Schreiben des auf LabView basierenden Codes, welcher für die Steuerung des Sortierprozesses verantwortlich ist

Enzymes have intrigued chemists to pursue their catalytic utility ever since their first reports. Due to their unparalleled versatility and selectivity, they provide an efficient and environmentally benign alternative to conventional organic synthetic methodology. Especially with the surge in recent identifications of new catalytically active proteins enabled by bioinformatics and developments in protein engineering, their use has increasingly found its place in the catalytic landscape. Herein de novo designed proteins derived by computational methods or directed evolution approaches using randomized structural mutations allow the chemist to delve into uncharted reaction territory. Especially the latter, however, requires sophisticated screening tools which can cope with the immense numbers of variants created by truly randomized approaches. Novel ultra-high-throughput screening (uHTS) systems enable the assessment of libraries of up to 107 samples using microfluidic devices and highly sensitive assays. Among these approaches, fluorescence-activated droplet sorting (FADS) systems entrap aqueous single-cell chemical reactors in pL sized droplets in perfluorinated media. Simultaneously encapsulated assay components interact with the target of choice enabling sensitive detection via laser-induced fluorescence (LIF). With the use of surfactants, coalescence of the droplets is prevented, and the readout can be directly correlated to individual enzymatic activity. However, a substantial water solubility of the assay components – correlated to logD values – was shown to be a prerequisite to impair the transport of fluorescent products between singular droplets through the continuous phase.This thesis aimed to develop analytical toolsets that would enable rapid evaluation of directed evolution libraries for two promiscuous enzymes using the FADS approach, namely the squalene hopene cyclase (SHC) and carboxylic acid reductase (CAR). In both cases, the envisioned enzymatic transformations were to yield carbonyl compounds that were either inherently fluorescent or detected via downstream conjugation with suitable fluorogenic reporters targeting the reactive carbonyl moiety.Initially, based on the recently discovered carbonyl activation mode of the SHC, a set of known citronellal derivatives were used to establish the novel biocatalytic system in the research group and elaborate its catalytic promiscuity for an enzymatic Prins reaction. Building upon these results, we targeted harnessing its Brønsted acidic catalytic machinery for an analogous cyclization of suitable fluorogenic aryl nucleophiles in a formal Friedel-Crafts acylation (FCA). Due to the lack of initial hits for the non-native transformation, we pursued an ultra-high-throughput approach to implement a carbonyl-selective sensor. Herein two distinct approaches were explored using already established carbonyl-specific assay tools based upon NBD (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole) and ABAO (amino benzamidoxime) reagents and adapted to be applicable in a FADS regime. This was achieved with the incorporation of hydrophilic groups, which minimized leakage across the droplet interface. Both synthesized water-soluble derivatives were proven to exhibit similar positive optical and kinetic profiles.Complementing the development of the chemical carbonyl assays, a novel custom-built FADS system was established at the TU Wien, covering the optical and optomechanical hardware assembly, installation of the microfluidic flow controller, the manufacture of microfluidic chips, and the writing of the LabView code for the final sorting process.