New click chemistry strategies for rapid radiolabeling

Abstract

Radiomarkierte Verbindungen nehmen eine Schlüsselrolle in der Diagnose und Therapie vieler Krankheiten ein. Die kurzen Halbwertszeiten sowie extrem niedrigen Konzentration stellen jedoch hinsichtlich der Herstellung eine intrinsische Limitierung dar, die bei Radioisotopen für die Bildgebung mittels PET besonders ausgeprägt ist. Die enormen Reaktionsgeschwindigkeiten bioorthogonaler Ligationen kombiniert mit einer modularen Strategie schaffen Abhilfe. Besonders hervorzuheben ist hierbei die Diels-Alder-Reaktion zwischen Tetrazinen und trans-Cyclooctenen (TCOs). Wesentliche Nachteile bei den derzeitigen Markierungsverfahren sind langwierige chromatographische Aufreinigungsschritte, die Verabreichung des Reaktionsgemisches ohne zuvor erfolgter Aufreinigung sowie eine kürzlich beschriebene Methode, die auf dem Abfangen des überschüssigen Precursors abzielt. Kombiniert man die klassische bioorthogonale Ligation (-Click-) mit der vor kurzem berichteten bioorthogonalen Elimination (-release-) eröffnet das eine neue Strategie für eine schnelle, effiziente und recyclebare Radiomarkierung (-Rapid Radiolabeling-). Das zugrundeliegende Prinzip ist die Immobilisierung eines Precursors über einen bioorthogonalen Linker an ein Bead. Trifft nun der radiomarkierte bioorthogonale Reaktionspartner auf den Linker so erfolgt zunächst eine Addition. Erst durch diesen -Click- wird die Freisetzung (-release-) des entstandenen Konjugates induziert. Zur Überprüfung dieser Idee und zur Untersuchung der Reaktion wurden drei Testsubstanzen in mehrstufigen Synthesen hergestellt. Kinetik-Messungen der Click-Reaktion zeigten Reaktionsgeschwindigkeiten ähnlich zu denen, beschrieben für literaturbekannte TCOs. Motiviert durch die kinetische Analyse wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein neues multifunktionelles TCO entwickelt. Erste Versuche zur bioorthogonalen Substitution zeigten eine eindeutige pH-Abhängigkeit des Elminierungsschrittes, wodurch kürzlich veröffentliche Resultate in der Literatur in Frage gestellt werden. Neben dem Einsatz in der Nuklearmedizin erweist sich die vorgestellte Strategie als universelle und vielfältige Methode für die Markierung und Modifikation von komplexen Verbindungen und Biomoleküle.

Radiolabeled molecules play a pivotal role in diagnosis and therapy of numerous diseases. However, short half-lives and extremely low concentrations are an intrinsic limitation of their production, in particular for radioisotopes commonly utilized in PET-Imaging. The advances of bioorthogonal chemistry enable to overcome these difficulties with a modular approach relying on unprecedented rates of ligation reactions. In this regard, several methods have been established on basis of the inverse electron-demand Diels-Alder reaction between tetrazines and trans-cyclooctenes to generate radiolabeled molecules. Cumbersome purification by HPLC, co-injections without prior purification and even a recently reported method of removing the interfering excess of precursor by a scavenger resin show major drawbacks. To address this challenge, we envisioned a novel rapid radiolabeling strategy combining two concepts of the bioorthogonal toolbox: (1) the classic bioorthogonal ligation (-click-) and (2) the recently emerged bioorthogonal elimination reaction (-release-). The underlying principle is the immobilization of a precursor molecule via a bioorthogonal linker on beads. Upon ligation with its bioorthogonal (i.e. radiolabeled) reaction partner and only induced by that click reaction the created conjugate is released. This would enable an efficient and recyclable radiolabeling technique through bioorthogonal substitution. For proof-of-concept and to investigate the reaction, test compounds were designed and synthesized. Kinetic evaluations of the click reaction showed reaction rates compared to currently used trans-cyclooctenes. Encouraged by our kinetic studies, we also developed and synthesized a promising new release trans-cyclooctene exhibiting higher reactivity and increased water solubility. Furthermore, first bioorthogonal substitution experiments indicated a pH-dependence of the release step casting doubt on the data interpretation of recently reported release kinetics in the literature. Apart from its application in nuclear medicine, our envisaged model system can be used for labeling and modifying compounds (incl. structurally complex biomolecules) with a variety of different tags, thus providing a universal and versatile tool for easy and efficient (bio)conjugation.