Faster, higher, stronger: molecular tools for ultra-efficient bioorthogonal chemistry

Abstract

In den letzten Jahren wurde erheblicher Aufwand darin betrieben, neue molekulare Werkzeuge zur zuverlässigen Diagnose und therapeutischen Behandlung von bösartigen Erkrankungen zu entwickeln. Wirkungsvolle Alternativen nicht nur zu Chemotherapeutika, sondern auch zur genauen Erkennung von erkranktem Gewebe werden heutzutage mehr denn je benötigt und medizinische Strategien zur gezielten Kontrolle von Krankheitsprozessen befinden sich noch in der Anfangsphase.Durch das Aufkommen der bioorthogonalen Chemie wurde gehofft, diesen sehr anspruchsvollen Anforderungen gerecht zu werden, da sie die Durchführung von synthetischen Transformationen in lebenden Systemen und das Studieren von Biomolekülen in ihrem natürlichen Umfeld erlauben, ohne dabei ihre biologischen Funktionen zu behindern. Keine der entwickelten bioorthogonalen Methoden kam an die überlegenen Eigenschaften der Reaktion zwischen trans-Cyclooctenen (TCOs) und 1,2,4,5-Tetrazinen (Tz), auch „Tetrazin Ligation“ genannt, heran. Aufgrund hoher Selektivität der Reaktionspartner, exzellenter Biokompatibilität und vor allem überaus schneller Reaktionskinetik, wurde die Tetrazin Ligation unverzichtbar für die Anwendung bioorthogonaler Chemie in vitro aber auch in vivo. Neben der Knüpfung von neuen chemischen Bindungen, ist es mit der Tz/TCO Chemie ebenfalls möglich Bindungen zu spalten, welches auch als „Click-to-Release“ bezeichnet wird und das bioorthogonale Einsatzgebiet auf diagnostische und therapeutische Anwendungen erweitert. Für den erfolgreichen Einsatz dieser bioorthogonalen Verbindungen in cellulo oder in vivo sind vorwiegend eine schnelle Reaktionsgeschwindigkeit und ausreichende Stabilität notwendig. Um effizient in biologische Prozesse eingreifen zu können, müssen bioorthogonale Spaltreaktionen überaus rapide erfolgen, um in sehr niedrigen Konzentrationen (sub-nM bis μM) einsetzbar zu sein. Außerdem muss der bioorthogonale Release ebenfalls schnell (d.h. Sekunden bis max. Minuten) und vor allem vollständig (>99%) ablaufen. Das Ziel dieser Arbeit ist, die Click- als auch Release-Performance der Tetrazin Ligation zu verbessern, um diese in biomedizinischen Bereichen wie Diagnostik, Pretargeting oder im gezielten Wirkstofftransport weiter zu etablieren. Mittels computergestützter Methoden werden neue Erkenntnisse präsentiert, um das Gleichgewicht zwischen hoher Reaktivität und ausreichender Stabilität von TCOs und Tz zu erhalten. Weiters wird die Synthese neuartiger trans-Cyclooctene und Tetrazine vorgestellt, welche schnellen UND vollständigen Release ermöglichen. Zudem werden spezielle Dual-Click-Tz für ihren Nutzen in der Nuklearmedizin erläutert.

Over the past decades, many efforts have been made to design new molecular tools for reliable diagnostic analysis and therapeutic treatment of malignant diseases. After all, effective alternatives not only for chemotherapeutics but also for the accurate detection of malicious tissue are currently of desperate need more than ever and medicinal strategies to specifically control disease processes still remain at an early stage. Since its introduction, bioorthogonal chemistry has held great promise to address these challenging demands by enabling scientists to perform chemical transformations in living systems and thereby to study biomolecules within their native habitat while not interfering with the biological functions therein. Among all bioorthogonal chemistries developed, none came close to the performance characteristics of the reaction between trans-cyclooctenes (TCOs) and 1,2,4,5-tetrazines (Tz), also referred to as “tetrazine ligation”. Due to the high selectivity of the reaction partners, excellent biocompatibility and most importantly its exceptional reaction kinetics, the tetrazine ligation has become an indispensable tool for in vitro and most notably in vivo applications of bioorthogonal chemistry. Besides the solely formation of new covalent linkages, the concept of bond-cleavage reactions using Tz/TCO chemistry (‘click-to-release’) has further expanded the repertoire of bioorthogonal methods for diagnostic and therapeutic applications. However, the restrictions for bioorthogonal tools to be applied in cellulo or even in vivo are limited first and foremost by their intrinsic reaction kinetics and sufficient stability. To selectively and efficiently compete with biological processes, there is a need for ultrafast bioorthogonal cleavage reactions that can be performed at low concentrations (sub-nM to μM). Moreover, for the bioorthogonal disassembly of (bio)active compounds or probes both, fast (i.e., seconds to minutes) and complete (>99%) release are key prerequisites.The objective of this thesis is to bridge the divide between the improvement of click and release performance of the tetrazine ligation to be applied in biomedical fields such as diagnostics, pretargeting and targeted drug delivery. With computational guidance, new insights in finding the right balance between high reactivity and decent stability of TCOs and Tz will be presented. Furthermore, this thesis focuses on the preparation of novel trans-cyclooctene- and tetrazine-tools to tweak the release performance of probes towards fast AND complete cleavage. Special dual-click Tz-scaffolds are finally discussed for its applicability in nuclear medicine.