A click chemistry-based strategy for the synthesis of enzyme substrates for newborn screening of Mucopolysaccharidosis

Abstract

Lysosomale Speicherkrankheiten bilden eine Gruppe von über 40 verschiedenen genetisch vererbten Stoffwechselerkrankungen, die alle zu den seltenen Erberkrankungen gehören. Einen großen Teil der lysosomalen Speicherkrankheiten bilden die Mukopolysaccaridosen. Normalerweise sollten die betroffenen Enzyme lineare Polysaccharide, sogenannte Glykosaminoglykane (GAGs) abbauen. Eine äußerst effiziente Nachweismethode ist die Durchführung eines Enzym Activitäts Assays mit anschließender Analyse mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie. Für die Optimierung und den Ausbau dieser Messmethode wurde eine auf Click-Chemie basierende Strategie entwickelt, mit der sich mit geringem Aufwand Enzymsubstrate für verschiedene Mukopolysaccaridosen herstellen lassen. Hierbei wird ein enzymspezifischer glykosidischer Teil mit einem Massenspektrometrie-optimierten Teil verknüpft. Mit der gleichen Strategie ist es ebenfalls möglich für jedes Enzymsubstrat den dazugehörigen internen Standard zu synthetisieren. Im Zuge der Arbeit wurden mehrere O-glykosylierte Enzymsubstrate mit ihren zugehörigen internen Standards für verschiedene Mukopolysaccaridosen hergestellt. Um höchstmögliche Intensitäten bei der Messung zu gewährleisten ist es nötig sicherzustellen, dass das Produkt der beobachteten Enzymreaktion anschließend nicht weiter abgebaut wird. Um dies zu erreichen wurden C- und N-glykosylierte Enzymsubstrate entwickelt, die nach einer Sulfat-Hydrolyse nicht weiter verdaut werden können. Weiters wurden die O-, C- und N-glykosylierte Substrate für MPS I, MPS II, MPS IVA und MPS VI mit Qualitätsmaterial und sofern vorhanden mit Patientenproben getestet und die jeweiligen Ergebnisse verglichen Im klinischen Alltag ist es wichtig möglichst viele Tests auf einmal durchzuführen um den Zeitaufwand gering zu halten. Hierbei kann mit der entwickelten Strategie ein sogenannter Multiplex durchgeführt werden. Erste Multiplex-Tests wurden erfolgreich durchgeführt und zeigten die gleichen Ergebnisse wie ihre Einzelmessungen, was zeigt, dass eine Multiplexanwendung möglich ist.

Lysosomal storage diseases form a group of over 40 different genetically inherited metabolic diseases, all of which are among the rare hereditary diseases. Mucopolysaccharidoses form a large part of the lysosomal storage diseases. Normally the affected enzymes should degrade linear polysaccharides, so-called glycosaminoglycans (GAGs) consisting of repeating disaccharide building blocks. A extremely efficient method for the detection of these diseases is an enzyme activity assay which will be analyzed with high-pressure liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. A strategy based on Click chemistry was developed for the optimization and expansion of this measurement method, with the aim of producing easy prepare able enzyme substrates for various mucopolysaccharidoses. In this case, an enzyme-specific glycosidic part is linked to a mass spectrometry-optimized part. With the same strategy, it is also possible to synthesize the corresponding internal standard for each enzyme substrate. In the course of the thesis, several O-glycosylated enzyme substrates were prepared with their associated internal standards for various mucopolysaccharidoses. In order to ensure the highest possible intensities in the measurement it is necessary to ensure that the product of the observed enzyme reaction is subsequently not further degraded. To achieve this, C and N-glycosylated enzyme substrates have been developed, which cannot be further digested after sulfate hydrolysis. Next, the O-, C- and N-glycosylated substrates were tested for MPS I, MPS II, MPS IVA and MPS VI with quality material and, if available, with patient samples and the respective results were compared with each other. In clinical practice, it is important to perform as many tests as possible at once in order to minimize the required time. With the developed strategy, a so-called multiplex can be implemented. First multiplex tests were carried out successfully and showed the same results as their individual measurements, which shows that multiplexing is possible.