Single-Molecule Analysis of Thyroid Peroxidase Membrane Mobility

Abstract

Die Thyroid-Peroxidase (TPO) ist ein membrangebundenes Enzym an der Oberfläche von Follikelzellen der Schilddrüse und spielt eine Schlüsselrolle in der Biosynthese wichtiger Schilddrüsenhormone. Neben dieser physiologischen Funktion ist TPO auch ein wichtiges Autoantigen bei autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen wie der Hashimoto-Thyreoiditis. Ihre enzymatische Funktion ist gut erforscht, über ihre räumliche Organisation und Dynamik an der Plasmamembran ist hingegen weniger bekannt. Diese Arbeit untersucht die Mobilität der TPO in lebenden Schilddrüsenzellen mittels Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie. TPO-Konstrukte, fusioniert mit dem monomeren Fluoreszenzprotein mBaoJin, wurden mittels lentiviraler Transduktion in humanen Nthy-Ori 3-1 Zellen exprimiert. Ein Großteil des rekombinanten Proteins blieb intrazellulär, höchstwahrscheinlich im endoplasmatischen Retikulum (ER). Deshalb wurden extrazelluläre Antikörper eingesetzt, um membranassoziierte TPO gezielt mittels Einzelmolekül-Tracking sowie Mean-Square-Displacement-Analyse (MSD) zu untersuchen. Antikörper-markierte TPO an der Plasmamembran teilte sich konstant in drei Mobilitätspopulationen auf: immobil, langsam diffundierend und schnell diffundierend, wobei die mobilen Fraktionen mit steigender TPO-Oberflächenexpression deutlich zunahmen. Die direkte Beobachtung des mBaoJin-Signals, das sowohl Membran- als auch intrazelluläre TPO gleichzeitig erfasst, zeigte eine vierte Population, die deutlich schneller diffundierte als jede der Membranfraktionen, welche vermutlich auf TPO im ER zurückzuführen ist. Der Abbau des Aktin-Zytoskeletts mittels Latrunculin B erhöhte die Mobilität sowohl membranassoziierter als auch intrazellulärer TPO, was darauf hindeutet, dass das kortikale Aktin-Zytoskelett die Diffusion von TPO beeinträchtigt. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in die Membrandynamik und intrazelluläre Retention von TPO in lebenden Zellen und könnten dazu beitragen, aufzuklären, wie die Membranorganisation die Zugänglichkeit von TPO und ihre Rolle bei autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen beeinflusst.

Thyroid peroxidase (TPO) is a membrane-bound enzyme located at the surface of thyroid follicular cells and plays a key role in the biosynthesis of thyroid hormones. In addition to its physiological function, TPO is also a major autoantigen in autoimmune thyroid diseases such as Hashimoto thyroiditis. Its enzymatic function has been studied extensively, but far less is known about its organization and its dynamic behavior at the plasma membrane. This work looks at TPO mobility in living immortalized thyroid cells using single-molecule fluorescence microscopy. TPO constructs fused to the monomeric green fluorescent protein mBaoJin were expressed in Nthy-Ori 3-1 human thyroid cells by lentiviral transduction. A large fraction of the recombinant protein stayed intracellular, most likely within the endoplasmic reticulum (ER). This made extracellular antibody labeling necessary to specifically study the plasma membrane-associated fraction for single-particle tracking and mean square displacement (MSD) analysis. Antibody-labeled TPO at the plasma membrane consistently split into three mobility populations: immobile, slow-diffusing, and fast-diffusing, with the mobile fractions growing significantly in cells overexpressing TPO. Direct imaging of the mBaoJin signal, which captures both membrane and intracellular TPO together, revealed a fourth population diffusing considerably faster than any of the membrane fractions, most likely representing ER-retained TPO. Disrupting the actin cytoskeleton with Latrunculin B increased the mobility of both membrane-associated and intracellular TPO, suggesting that the cortical actin cytoskeleton constrains TPO diffusion. These findings add to our understanding of TPO's membrane dynamics and intracellular retention in living cells and may help clarify how membrane organization shapes TPO accessibility and its role in autoimmune thyroid disease.